基于杜仲叶提取物的安全评价及抗衰老活性研究

基于杜仲叶提取物的安全评价及抗衰老活性研究

李庚¹，张小娜¹，帖航¹，王雪松²，吴晓岚¹，张清杰，彭密军^1，2*

（1.中国检验检疫科学研究院粤港澳大湾区研究院，广东  中山  528437；2.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东  广州  510070）

一、问题的提出

原料是化妆品的核心，而在众多的化妆品原料中，基于天然活性成分的植物原料始终是日化领域开发研究的热点。植物原料优势显著，如刺激性相对较低、安全性相对较高，同时具有多靶点等。在《已使用化妆品原料目录（2021年版）》中，有3400余种植物原料被收载使用，包括大量的植物提取物。当前，国产各化妆品品牌都在争相开拓基于植物原料的产品，试图走出一条与国际大牌错位竞争的特色道路。植物提取物一般富含多种天然活性成分，但同时存在大量未知杂质，缺乏系统的安全性数据支撑。

杜仲被誉为“中国神树”，是我国特有的林源植物资源。杜仲全身是宝，皮、叶、雄花、果等部位均具有极高的综合开发价值。20世纪以来，国内外学者从杜仲中提取获得的生物活性成分多达130余种。杜仲叶中的特征成分有绿原酸（CA）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）和槲皮素（QU）等。虽然《T/CCCMHPIE 1.46-2019 植物提取物 杜仲叶提取物》团体标准^［1］已经出台，但只规定了绿原酸含量以及重金属、微生物等常规安全检测的指标，缺乏更加深入的遗传毒性方面的安全评价。

对杜仲叶提取物的安全评价进行研究，可开展遗传毒性试验，并且对杜仲叶提取物抗氧化、抑菌活性进行观察。同时，进一步从细胞周期、细胞凋亡和细胞衰老等方面探究杜仲叶特征成分绿原酸（CA）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）和槲皮素（QU）的抗衰老活性。

二、方法与分析

（一）遗传毒性评价

遗传毒性是引起健康问题的主要原因之一，遗传毒性评价是安全评价的一个重要组成部分。本研究根据国家标准（GB 15193.4-2014、GB 15193.5-2014、GB 15193.28-2020、GB15193.20-2014），对杜仲叶提取物进行了细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳动物细胞微核试验、体外Thymidine Kinase基因突变试验4项遗传毒性试验（见附录表1～表4）。

结果表明，杜仲叶提取物处理下标定菌株的回复突变数与溶剂处理相当，说明杜仲叶提取物不会引起基因回复突变；杜仲叶提取物处理下哺乳动物红细胞和体外哺乳动物细胞的微核率接近或显著低于溶剂处理，说明杜仲叶提取物没有引起染色体畸变；与溶剂对照相比，杜仲叶提取物处理下Thymidine Kinase基因总突变频率变化小于3倍，说明杜仲叶提取物不会引起Thymidine Kinase基因突变。综合以上结果，证明杜仲叶提取物无遗传毒性。

（二）杜仲叶提取物抗氧化活性评价

本研究参考王翔等^［2］提出的方法，对杜仲叶提取物的抗氧化能力进行研究，考察其清除自由基（·OH，DPPH·，PTIO·，ABTS·）的能力（见图1）。

*ELE为杜仲叶提取物，VC为维生素C。

图1  抗氧化能力实验

结果表明，杜仲叶提取物对4种典型（·OH，DPPH·，PTIO·，ABTS·）自由基的清除率随浓度的增加而升高，说明杜仲叶提取物有清除自由基的能力，且有浓度依赖性。

（三）杜仲叶特征成分抗衰老活性评价

为了考察杜仲叶特征成分绿原酸（CA）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）和槲皮素（QU）的抗衰老活性，本研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行细胞周期、细胞凋亡^［3，4］和细胞衰老实验^［5，6］（β-半乳糖苷酶染色实验）（见图2、图3、表5）。

图2  人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞周期实验

图3  人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的β-半乳糖苷酶染色实验

表5  人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞凋亡实验

*CA、GPA、AU和QU分别为绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷和槲皮素

研究表明，细胞周期研究可以推断出杜仲叶的特征成分积极参与了DNA修复和正常的DNA合成过程，能有效减缓由H₂O₂引起的细胞周期紊乱；细胞凋亡的研究说明经过H₂O₂诱导的细胞凋亡率会增加，与对照组相比较，杜仲叶特征成分具有抑制细胞凋亡的作用；细胞衰老的研究中，H₂O₂诱导HUVEC细胞致其损伤可加速衰老，采用β-半乳糖苷酶试剂盒对细胞进行染色后分析，与对照组相比，杜仲叶的特征组分添加可以降低细胞阳性率，说明杜仲叶的特征成分具有保护细胞的能力，并能缓解由H₂O₂引起的细胞衰老。

（三）抑菌活性评价

杜仲叶优异的抑菌性能已经得到广泛认可。本研究参考国家标准（GB 4789.3-2016、GB 8538-2008、GB 4789.10-2016、GB 4789.16-2016、GB 8538-2016），对杜仲叶提取物开展了抑菌活性实验（见表6）。

表6  抑菌活性实验

*不同小写字母表示不同处理组间存在显著性差异（P < 0.05）。

结果表明，杜仲叶提取物对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有良好的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制率达80%以上，对铜绿假单胞菌的抑制率达58.93%～98.19%。杜仲叶提取物对大肠杆菌和黑曲霉具有一定的抑制效果，抑制率为34.08%～58.30%。

三、结论

通过以上研究可知，杜仲叶提取物不会引起基因回复突变、不会引起染色体畸变、不会引起TK基因突变，证实了杜仲叶提取物无遗传毒性。抗氧化方面，杜仲叶提取物可有效清除4种典型自由基（·OH，DPPH·，PTIO·，ABTS·）。并且，杜仲叶特征成分绿原酸（CA）、京尼平苷酸（GPA）、桃叶珊瑚苷（AU）和槲皮素（QU）能有效减缓由H₂O₂引起的细胞周期紊乱，具有抑制细胞凋亡的作用。β-半乳糖苷酶染色实验显示杜仲叶特征组分可以降低细胞阳性率，说明杜仲叶特征成分具有保护细胞的能力，并能缓解由H₂O₂引起的细胞衰老。抑菌方面，杜仲叶提取物对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有良好的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制率达80%以上，对铜绿假单胞菌的抑制率达58.93%～98.19%。对大肠杆菌和黑曲霉也具有一定的抑制作用，抑制率为34.08%～58.30%。

综上所述，杜仲叶提取物安全，且具有抗氧化、抗衰老和抑菌活性，在化妆品领域具有广阔的应用前景。

［参考文献］

［1］彭密军，张命龙，黄日升，等.T/CCCMHPIE 1.46-2019 植物提取物 杜仲叶提取物［S］.北京：中国商务出版社，2020.

［2］王翔，胡凤杨，杨秋玲，等.杜仲叶的营养评价及体外抗氧化活性分析［J］.食品工业科技，2019，40（21）：290-299.

［3］Kim S H，Lee J C.Quercetin Protects Hepatocytes against CCl4-Induced Apoptosis via SIRT1 Regulation［J］.Cell and Tissue Biology，2021，15（4）：   .

［4］Zorić Nataša，Kopjar Nevenka，Rodriguez Jadranka Vuković，et al.Protective effects of olive oil phenolics oleuropein and hydroxytyrosol against hydrogen peroxide-induced DNA damage in human peripheral lymphocytes［J］.Acta pharmaceutica (Zagreb,Croatia)，2021，71（1）：    .

［5］Ling Yun，Lu Na，Gao Ying，et al.Endostar induces apoptotic effects in HUVECs through activation of caspase-3 and decrease of Bcl-2［J］.Anticancer research，2009，29（1）：   .

［6］Debacq-Chainiaux Florence,Erusalimsky Jorge D，Campisi Judith，et al.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-betagal) activity,a biomarker of senescent cells in culture and in vivo［J］.Nature protocols，2009，4（12）：   .